كشف الحمض النووي الفيروسي

تم التعرف على التسلسل الجينومي لمعظم الفيروسات.مجسات الحمض النووي وهي عبارة عن أجزاء قصيرة من الحمض النووي مصممة للتهجين مع مقاطع DNA أو RNA الفيروسية التكميلية.تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو تقنية أكثر كفاءة للكشف عن الفيروس.تم تطوير طرق تشخيص عالية الإنتاجية مؤخرًا.

تقنية تهجين الحمض النووي

تهجين الحمض النووي ، بما في ذلك النشاف الجنوبي (الجنوبي) والنشاف الشمالي (الشمالي) ، هو تقنية جديدة سريعة التطور في مجال تشخيص الفيروس.الأساس المنطقي لمقايسة التهجين هو استخدام أجزاء قصيرة من DNA (تسمى "المسبار") مصممة للتهجين مع مقاطع DNA أو RNA الفيروسية التكميلية.عن طريق التسخين أو المعالجة القلوية ، يتم فصل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المستهدف مزدوج الشريطة إلى خيوط مفردة ثم يتم تثبيتها على دعامة صلبة.بعد ذلك ، يتم إضافة المسبار وتهجينه مع الحمض النووي المستهدف أو الحمض النووي الريبي.نظرًا لتسمية المسبار بالنظير أو النيوكليدات غير المشعة ، يمكن اكتشاف الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المستهدف من خلال التصوير الشعاعي الذاتي أو نظام البيوتين أفيدين.نظرًا لأن معظم الجينومات الفيروسية قد تم استنساخها وتسلسلها ، فيمكن اكتشافها باستخدام تسلسلات خاصة بالفيروس كمجسات في العينة.حاليًا ، تشمل طرق التهجين: لطخة نقطية ، تهجين في الموقع في الخلايا ، نشاف الحمض النووي (DNA) (لطخة جنوبية) ونشاف RNA (RNA) (لطخة شمالية).

تقنية B.PCR

في السنوات الأخيرة ، تم تطوير سلسلة من تقنيات تضخيم الحمض النووي في المختبر بناءً على تفاعل البوليميراز المتسلسل لاختبار الفيروسات غير الحساسة أو غير القابلة للزراعة.PCR هي طريقة يمكنها توليف تسلسل DNA محدد عن طريق تفاعل البلمرة في المختبر.تتضمن عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل دورة حرارية من ثلاث خطوات: التمسخ ، التلدين ، والتمديد عند درجة حرارة عالية (93 ~ 95 ℃) ، يتم فصل الحمض النووي مزدوج الشريطة إلى شريطين فرديين من الحمض النووي ؛ثم عند درجة حرارة منخفضة (37 ~ 60 ℃) ، يقوم اثنان من بادئات النيوكليوتيدات المركبة بالتصلب إلى مقاطع الحمض النووي التكميلية ؛بينما عند درجة الحرارة المناسبة لإنزيم Taq (72 ℃) ، يبدأ تخليق سلاسل DNA الجديدة من التمهيدي 3 وينتهي باستخدام DNA التكميلي كقوالب ونيوكليوتيدات مفردة كمواد.لذلك بعد كل دورة ، يمكن تضخيم سلسلة DNA واحدة إلى سلسلتين.بتكرار هذه العملية ، يمكن استخدام كل سلسلة DNA يتم تصنيعها في دورة واحدة كقالب في الدورة التالية ، ويتضاعف عدد سلاسل الحمض النووي في كل دورة ، مما يعني تضخيم إنتاج PCR بسرعة سجل 2n.بعد 25 إلى 30 دورة ، يتم تحديد إنتاج تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال الرحلان الكهربائي ، ويمكن ملاحظة منتجات الحمض النووي المحددة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (254 نانومتر).لميزة الخصوصية والحساسية والملاءمة ، تم اعتماد تفاعل البوليميراز المتسلسل في التشخيص السريري للعديد من أنواع العدوى الفيروسية مثل HCV و HIV و CMV و HPV.نظرًا لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل حساس للغاية ، فيمكنه اكتشاف الحمض النووي للفيروس على مستوى fg ، يجب إجراء العملية بحذر شديد لتجنب النتائج الإيجابية الزائفة.بالإضافة إلى ذلك ، النتيجة الإيجابية في اختبار الحمض النووي لا تعني وجود فيروس معدي حي في العينة.

مع التطبيق الواسع لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تم تطوير تقنيات وطرق جديدة تعتمد على تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل لأغراض الاختبار المختلفة.على سبيل المثال ، يمكن أن يكشف PCR الكمي في الوقت الحقيقي عن الحمل الفيروسي ؛يستخدم PCR في الموقع لتحديد عدوى الفيروس في الأنسجة أو الخلايا ؛يمكن أن يزيد PCR المتداخل من خصوصية PCR.من بينها ، تم تطوير PCR الكمي في الوقت الحقيقي بسرعة أكبر.تم دمج العديد من التقنيات الجديدة ، مثل مسبار التحلل المائي TaqMan ، ومسبار التهجين ، ومسبار المنارة الجزيئي ، في تقنية PCR الكمية في الوقت الفعلي ، والتي تستخدم على نطاق واسع في الأبحاث السريرية.إلى جانب تحديد الحمل الفيروسي في سوائل جسم المريض بدقة ، يمكن أيضًا استخدام هذه الطريقة للكشف عن الطفرات التي تتحمل الأدوية.لذلك ، يتم تطبيق PCR الكمي في الوقت الحقيقي بشكل أساسي في تقييم التأثير العلاجي ومراقبة تحمل الأدوية.

ج- الكشف عالي الإنتاجية عن الأحماض النووية الفيروسية

لتلبية احتياجات التشخيص السريع للأمراض المعدية الناشئة الجديدة ، تم إنشاء العديد من طرق الكشف عالية الإنتاجية ، مثل رقائق الحمض النووي (DNA).بالنسبة لرقائق الحمض النووي ، يتم تصنيع مجسات محددة وربطها برقائق السيليكون الصغيرة بكثافة عالية جدًا لتشكيل ميكروأري لمسبار الحمض النووي (DNA) والذي يمكن تهجينه مع العينة.يمكن تصوير إشارة التهجين بواسطة مجهر متحد البؤر أو ماسح ضوئي بالليزر ومعالجتها بشكل أكبر بواسطة الكمبيوتر ويمكن الحصول على مجموعة بيانات ضخمة تتعلق بالجينات المختلفة.هناك نوعان من شرائح الحمض النووي.تكون "شريحة التوليف" على النحو التالي: يتم تصنيع الأوليغنوكليوتيدات المحددة مباشرة على الرقائق.آخر هو رقاقة تجمع الحمض النووي.تتم طباعة الجينات المستنسخة أو منتجات PCR بشكل منظم على الشريحة.ميزة تقنية شرائح الحمض النووي هي الاكتشاف المتزامن لكمية هائلة من تسلسلات الحمض النووي.يمكن لأحدث إصدار من شريحة الكشف عن مسببات الأمراض التعرف على أكثر من 1700 فيروس بشري في وقت واحد.حلت تقنية شرائح الحمض النووي مشاكل طرق تهجين الحمض النووي التقليدية ولها تطبيقات واسعة جدًا في التشخيص الفيروسي والدراسة الوبائية.